Противомикробные препараты на растительной основе

Summary

Развитие резистентности к антибиотикам у патогенных бактерий является сегодня большой проблемой.  Противомикробные препараты на растительной основе являются альтернативой антибиотикам, так как к ним резистентность не вырабатывается. Поэтому исследование в этом направлении перспективно, имеет большую научную ценность и новизну.

Главной задачей нашего проекта было найти растения, фитонциды которых проявляют токсичность в отношении патогенных бактерий, простейших и грибов. Для осуществления проекта были использованы самые разнообразные методы и методики. Например, наиболее значимые результаты были получены при подсчете бактерий в камере Горяева,  микроскопии (оптической, электронной).

Получены такие результаты: сок калины нейтрально влияет на рост кишечной палочки, но влияет на ее цитокинез, ингибирует рост золотистого стафилококка, повышает количество гаплоидных клеток дрожжей пекарских, оказавает цитотоксическое действие на инфузорию туфельку. Сок свеклы стимулирует рост бактерий, но проявляет достаточно высокую активность относительно инфузории туфельки. Эфирное масло моркови посевной имеет умеренную активность относительно дрожжей пекарских, низкую токсичность для инфузории туфельки.

Наша гипотеза была подтверждена, так как были открыты новые свойства экстрактов растения, фитонцидная активность которых недооценивалась. На их основе стоит разработать противомикробные препараты. Сок свеклы можно использовать для улучшения питательных свойств сред при культивировании микроорганизмов. Также сок свеклы потенциально возможно использовать для очищения воды  от простейших, например, в бедных странах,  аквариумистике, сельском хозяйстве.

 В данный момент ведем работу по разработке препарата против угревой сыпи на основе сока калины.  В дальнейшем планируем расширить спектр исследуемых растений.

Question / Proposal

Для лечения инфекционных заболеваний часто используют антибиотики. Проблема заключается в том, что бактерии способны приобретать резистентность к подобным соединениям. Например, для деактивации пенициллина бактерии производят ферменты б-лактамазы, которые кодируються генами плазмид, что в конечном счете приводит к распространению резистентности даже среди разних видов. Это заставляет искать новые лекарства в природе. Например, компания Бионорика разрабатывает лекарства на основе растений и их фитонцидов. В Украине множество людей лечится народными методами. При этом большинство таких методов вовсе не было исследовано наукой. Во время нашего исследование было выявлено крайнюю неэффективность сока свеклы при лечении бактериальных заболеваний (КОЕ/мл золотистого стафилококка в присутствии сока было в 7 раз больше чем в контроле). Поэтому исследование является перспективным и имеет достаточную научную новизну. Исследование было проведено на высоком уровне с использованием разнообразных методов на базе лаборатории вирусологии ИСМАПП НААН Украины в городе Чернигове.

Цель исследования: определить фитонцидную активность екстрактов калины, свеклы и моркови посевной относительно бактерий, простейших и одноклеточных грибов.

Задачи исследования:

1.Ознакомиться с некоторыми видами растений, бактерий, грибов, простейших и особенностями их жизнедеятельности.

2.Овладеть разнообразными методиками (микробиологическими).

3.Непосредственно исследовать фитонцидную активность растений.

4.Проанализировать результаты и предложить практическое применение.

Объекты исследования: жизнедеятельность кишечной палочки (Escherichia coli ), золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus ), инфузории туфельки (Paramecium caudatum), дрожжей пивных (Saccharomyces cerevisiae).

Предмет исследования:  жизнедеятельность кишечной палочки, золотистого стафилококка, инфузории туфельки, дрожжей пивных под влиянием экстрактов калины (Viburnum opulus), свеклы (Beta vulgaris) и  моркови посевной (Daucus carota subsp. sativus).

 

 

Research

Лекарства на основе растений и их компонентов были первыми эффективными препаратами против инфекционных заболеваний. Их начали применять тысячи лет назад. Естественно, эффективные фитонциды находили исключительно эмпирическим путем. В двадцатом веке были открыты антибиотики. Например, пенициллин (активен за счет бета-лактамного кольца). При этом через несколько месяцев уже были зафиксированы первые случаи резистентности к пенициллину. 

Особеностью препаратов на основе растительных фитонцидов является широкий спектр механизмов действия. Микроорганизмы могут адаптироваться к нескольким из них, но к большей части  приобретение резистентности во время лечения просто невозможно. Следствием этого является высокая активность препаратов на протяжении большого периода времени. 

Существует еще одно преимущество растительных препаратов над антибиотиками. Как известно резистентность к большинству антибиотиков вызывается особыми ферментами (белками, код которых содержится в плазмидной ДНК и геноме). Фермент специфически связывается с антибиотиком. Также благодаря горизонтальному переносу генов (плазмидами) резистентность распространяется между различными штаммами и даже видами. При возникновении же устойчивости с определенному механизму действия фитонцидов, резистентность не может передаваться при горизонтальном переносе генов так как не кодируется отдельным геном. Поэтому наше исследование достаточно актуально на сегодняшний день.

Впервые в современном мире про фитонциды заявил в 1928 году  биолог Борис Петрович Токин. Он ввел этот термин относительно химических соединений, которые могут быть обнаружены в растениях и негативно влияют на жизнедеятельность микроорганизмов. 

Природа фитонцидов разнообразна. Многие фитонциды являются эфирными маслами, терпенами, органическими кислотами. Некоторые фитонциды не могут быть собраны в достаточных для анализа концентрациях. 

Фитонциды играют важную роль в имунитете растений. Выделение больших количеств фитонцидов происходит при повреждении растений. Летучие фракции действуют на растоянии, например фитонциды листьев дуба, эвкалипта, сосны и многих других растений. Активность и спектр антимикробного действия фитонцидов разнообразны. Соединения чеснока, лука, хрена убивают многие виды бактерий, простейших (на примере инфузорий) и низших грибов  в первые минуты и секунды, а насекомых за несколько минут или часов. Чаше всего активность относительно бактерий проявляется  в снижении  КОЕ/см3. Некоторые фитонциды (лука, хрена, горчицы) убивают клетки дрожжей за 2-3 минуты. Под действием фитонцидов у инфузорий  меняется морфология клеток: пропадает перистом, увеличиваются вакуоли, возникает зернистость цитоплазмы, в макронуклеусе может быть обнаружена фрагментация. Активность проявляется не только в подавлении роста, но и в негативном хемотаксисе, стимулировании роста микроорганизмов антогонистов. 

Из этих растений наиболее изучены фитонцидные свойства калины. Сок калины в концентрации  7% проявляет активность относительно дизентерийной, брюшнотифозной палочки, возбудителя сибирской язвы. Настои цветов и листьев в концентрации 5% та 10% имеют активность относительно сарцин, лимонно-желтого стафилокока, бацили сибирськой язвы. Сальмонели брюшного тифа (Salmonella typhi), золотистый стафилококк были не чувствительны к этим препаратам. Также было доказано токсичность ягод калины относительно лямблий и трихомонад. Активность экстрактов свеклы и моркови изучена слабо. В народной медицине используют все эти растения. Сок буряка используют при воспалительных процесах, остром тонзиллите. Сок калины используют при бактериальных заболеваниях, остром тонзиллите, угревой сыпи.

Таким образом, после анализа литературы, нами были выбраны наимение изученые и  наиболее распостраненные в  умеренном климатическом поясе Украины растения. Были отобраны основные методики проведения исследования и модельные организмы (золотисный стафилококк - грампозитивная бактерия, представитель микрофлоры человека, возбудитель многих заболеваний, кишечная палочка  - грамнегативная бактерия, инфузория туфелька - традиционный обьект, представитель простейших и дрожжи - ценный промышленный вид). 

Method / Testing and Redesign

Получение экстрактов

Для проведения исследования необходимо было получить экстракты растений. Для получения экстрактов свеклы и калины, соки этих растений упаривали на водяной бане в два раза. Хранились они при температуре не выше 10 градусов. Водную эмульсию эфирного масла моркови получали при дистиляции измельченных семян с водой (не дольше 10 минут за раз), лучше отдельными порциями по 25 г. В итоге получалась мутная жидкость с запахом моркови, клубники, земли и дыма с концентрацией масла не более 10%.

Питательные среды

Для культивирования бактерий использовался МПА (питательный агар). Среда готовится по стандартному рецепту из 30 г концентрата на 1 литр дистиллята. При культивировании инфузории туфельки использовался сенный настой. Для дрожжей использовалась среда с сахаром, крахмалом, хлоридом натрия. Для лучшей сохранности и удобства использования в нее был добавлен хлорамфеникол. 

Схема исследования фитонцидной активности. 

Для определения активности растений относительно бактерий, последних инкубировали в присутствии экстракта (Эксперимент) и отсутствии (Контроль) экстрактов. Для непосредственного определения активности использовали такие методы: подсчет колоний (с кишечной палочкой оценка внешнего вида посева, так как бактерии росли в виде бактериальной пленки), определение КОЕ/мл в камере Горяева, электронная и оптическая микроскопия. При работе с бактериями соблюдались все меры безопасности. Перед использованием посуда автоклавировалась, все  пересевы производились в ламинарном боксе, после исследования посуда обрабатывалась щелочью. 

Дрожжи культивировались аналогично бактериям. Для определения КОЕ/мл клетки подсчитывались в одном поле зрения микроскопа МБР-3 20х1,5х10. Оценивался внешний вид посевов. Материал для посева состоял из 3 мл воды и 100 мг сухих дрожжей, растворенных при постоянном перемешивании на протяжении нескольких минут. К каждой пробирке было добавлено 0,1 мл материала. В Контроли добавлялось 0,5 мл воды, в Эксперименты - 0,5 мл исследуемого экстракта. Подсчеты были выполнены через 24 и 48 часов. Статистическая обработка проводилась с помощью теста Стьюдента.

Исследование активности экстрактов относительно инфузории туфельки проводилось по методу пробы с простейшими. Статистическая обработка была исполнена по тесту Стьюдента.

Некоторые из методик 

Здесь приведены некоторые из мало извесных, либо измененных методик. Стандартные приводить нецелесообразно. 

Определение КОЕ/мл без камеры Горяева использовалось в эксперименте в дрожжами. Культура разводилась водой до оптимальной концентрации (подбирается эмпирическим путем) для лучшего разделения клеток можно использовать раствор серной кислоты. При желании можно окрасить культуру метиленовым синим в низкой концентрации (прокрашиваються мертвые клетки). После необходимо поместить 0,01 мл этой жидкости между двумя покровными стеклами 20х20 мм. Клетки подсчитывают в 8-10 полях зрения. Количество клеток в 1 мл оприделяют по формуле N(0,01)xS(S0), где N - среднее число клеток в одном поле зрения, S - площадь покровного стекла, S0 - площадь поля зрения микроскопа.  Характеристики микроскопа МБР-3

Объектив Собственное увеличение

Поле зрения 

с окуляром 10х, мм

10х0,3 10 1,3
20х0,65 20 0,65
60х1 (масляная иммерсия) 60 0,22
90х1,23 (масляная иммерсия) 90 0,15

 

Определение фитонцидной активности относительно простейших. Необходимо смешать культуру протистов с экстрактом. С помощью микроскопа и секундомера необходимо зафиксировать время смерти клеток (лизис, везикуляция, нарушение осмотического баланса, прекращение движения). Далее необходимо поделить 100 на полученое число, это и есть коэффициент фитонцидной активности. 

Электронная микроскопия на микроскопе TESLA BS540. Смывы наносились на медную сетку, фиксировались эфиром и красились ФВК. 

Остальные методики стандартные, например окраска мазков по Граму, оптическая микроскопия.

 

Results

Активность экстрактов относительно кишечной палочки (Escherichia coli)

Влияние сока свеклы на кишечную палочку. В Контроле и Эксперименте бактерии росли в виде бактериальной пленки. Контроль имел запах манной каши,  Эксперимент имел пыльный запах. При электронной микроскопии были выявлены такие особенности морфологии: в присутствии сока свеклы у бактерий развивается мощная оболочка из слизи, клетки укорочены. С помощью камеры Горяева  определили КОЕ/мл. В Контроле оно составляло 19,2×10в Эксперименте - 24,5× 106. Таким образом коэфициент фитонцидной активности (соотношение КОЕ/мл в Контроле к Эксперименту, КФА)  равнялся 0,7. 

Действие упаренного сока калины на кишечную палочку. При смешивании сока с МПА в первые 30-120 минут  происходило образование пленки. При изготовлении фиксированого мазка и окраске по Граму бактерий выявлено не было. То есть пленка является следствием химической реакции. В Эксперименте колоний было больше. При электронной микроскопии были выявлены особенности морфологии. В Эксперименте клетки были намного длинее, что свидетельствует об ингибировании экстрактом цитокинеза. 

 Контроль, 22000х

 Эксперимент, 22000х

КФА составил 1,02. Таким образом экстракт слабо влияет на КОЕ/мл кишечной палочки, но влияет на жизненные циклы клеток.

Активность экстрактов относительно золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus)

Влияние упареного сока свеклы на золотистого стафилококка. В Эксперименте коллоний было в несколько  сотен больше чем в Контроле.Уже на этом этапе видно позитивное влияние сока на золотистого стафилококка. При электронной микроскопии было выявлено больше слизи в Контроле, форма микроколонии в Эксперименте неправильная.

 Контроль, 16000х

 Эксперимент, 16000х

КФА равнялся 0,14. Таким образом сок свеклы позитивно влияет на золотистого стафилококка, с помощью него можно увеличить КОЕ/мл в несколько раз.

Влияние сока калины на золотистого стафилококка. В Контроле было более сотни колоний, в Эксперименте колонии не были обнаружены, но при оптической микроскопии бактерии были выявлены, что свидетельствует о развитии стафилококка в виде пленки.

 Эксперимент, 1350х, масляная иммерсия, метиленовый синий

При электронной микроскопии особенностей морфологии не было выявлено. КФА равнялся 1,42. Так как подсчет в камере Горяева был произведен позже чем через сутки, то истинная активность намного выше. Таким образом сок калины ингибирует рост золотистого стафилококка, наибольшая активность наблюдаеться в первые несколько суток. 

Активность сока калины была протестирована in vivo, через несколько дней и недель использования против угревой сыпи кожа приобрела здоровый вид, количество угрей заметно снизилось. 

Активность экстрактов относительно дрожжей пивных (Saccharomyces cerevisiae)

Влияние водной эмульсии эфирного масла моркови посевной на дрожжи пивные. Через 24 часа  больше всего пузырьков было в Контроле, в Эксперименте они отсутствовали.  КФА равнялся 1,08. Через 48 часов - 1,76. Резузьтаты во всех тестах с дрожжами  за тестом Стьюдента статистически достоверные. 

Динамика развития дрожжей

Влияние сока калины на дрожжи. Через 24 часа КФА равнялся 1,28, через 48 часов - 1,15.

При оптической микроскопии была показана способность сока влиять на смену поколений дрожжей (повышение килличества гапплоидных клеток).

 Контроль, 300х

 Эксперимент, 300х

Влияние экстрактов на инфузорию туфельку (Paramecium caudatum)

Сок калины убивает протистов за 5,6 с со статистической ошибкой в 1,8 и КФА 20,7. Сок свеклы убивает инфузорий за 36,4 с с ошибкой в 18,5 и КФА 3,4 особенностью является позитивный хемотаксис инфузорий. Наименьшую активность проявило эфирное масло моркови с временем смерти 137.7 с, ошибкой 57,8 и КФА 0,7.

  Контроль

 Действие экстракта калины

 Действие экстракта моркови

 

Conclusion

На основании полученных результатов можно сделать такие выводы:

1.Сок свеклы не стоит использовать для лечения бактериальных заболеваний, например острого тонзиллита, заболеваний кожи, желудочно-кишечного тракта, так как было доказано позитивное влияние экстракта на жизнедеятельность золотистого стафилококка и кишечной палочки. Использование сока может только усугубить болезнь.

2.Упареный сок калины слабо влияет на Saccharomyces cerevisiae, но было замечено влияние на чередование диплоидных и гаплоидных поколений, повышая количество последних. Также клетки становятся мельче. 

3.Упареный сок калины имеет умеренные бактериостатические свойства относительно золотистого стафилококка и нейтральные относительно кишечной палочки. 

4.Водная эмульсия эфирного масла моркови посевной проявляет умеренную фитонцидную активность относительно Saccharomyces cerevisiae. Действие проявляется в снижении КОЕ/мл.

5.Можна прогнозировать эффективность лечения бактериальных заболеваний препаратами на основе сока калины. В особенности, заболеваний вызваных золотистым стафилококком.

6.Упареный сок калины, свеклы, водная эмульсия эфирного масла моркови проявляют высокую, умеренную и низкую активность относительно Paramecium caudatum, соответственно.

7.Фитонциды могут проявлять совершенно неожиданную активность. Например сок буряка был не активен по отношеию к бактериям, но активность относительно простейших оказалась достаточно высокой. Это подтверждает необходимость дальнейших исследований для выявления новых свойств растительных фитонцидов и непосредственно новых фитонцидов.

 

Практическое значение 

Исследование показало, что сок свеклы (Beta vulgaris) очень позитивно влияет на рост бактерий. Его можна использовать как добавку к питательным средам для повышения выхода биомассы. Сок имеет яркий цвет, также повышает выделение бактериями слизи, что может исспользоваться для выявления колоний. То есть контрастность и резкость колоний повышаются. 

На основе сока калины стоит разработать препататы направленые на лечение и профилактику бактериальных заболеваний. Так как было выявлено активность экстракта относительно представителей кокковой микрофлоры человека. 

Так как ативность сока свеклы относительно бактерий не была выявлена, а по отношению к инфузории туфельке она была достаточно высокой, экстракт можно использовать для выборочной очистки воды от простейших. Это может быть использовано при выделении новых штаммов, создании элективных питательных сред. Также сок свеклы может быть использован в аквариумистике и сельском хозяйстве для выборочной очистки от простейших. 

Сравнение антибиотиков и препаратов на растительной основе

Характеристика  Антибиотик     Препарат на основе фитонцидов
Стоимость сырья Высокая  Низкая
Активность Высокая От средней до высокой
Токсичность для человека Высокая  Низкая
Сложность производства Высокая  Низкая
Развитие резистентности Высокая вероятность  Низкая вероятность
Приминение Лечения острых инфекционных заболеваний, реже для профилактики Лечение острых инфекционных заболеваний, чаще  профилактика
Спектр действия Бактерии Бактерии, вирусы, грибки
Побочные эффекты Сильные Практически отсутствуют

 

Из таблицы видно, что создание препаратов на растительной основе очень перспективно. Они  не смогут полностью заменить антибиотики, но станут полезным альтернативным инструментом в руках врачей. 

Таким образом гипотеза исследования была подтверждена. Выбраные растения имели разнообразный спектр действия. После анализа полученых результатов были предложены наиболее перспективные сферы и способы применения экстрактов растений. Исходя из вышеизложенного, эксперимент можна назвать успешным. 

About me

Здравствуйте!

Я, Михаил Штопко, на данный момент являюсь учеником 10 класса  школы №1 города Чернигова, Украина. Когда я узнал про конкурс, то понял, что обязательно должен взять в нем участие, так как это прекрасная возможность показать миру свои исследования, приобрести полезный опыт и завести много новых знакомств. 

Мое исследование относится к области биологии и медицины, в частности к микробиологии.  Также я сейчас занимаюсь разработкой метода генной модификации бактерий  в домашних условиях (на основе коньюгации). Потенциально такой метод в сотни раз дешевле традиционного. У меня  много идей в сфере физики, интеллектуальных технологий, искусства (в этом году я оканчиваю музыкальную школу),  провожу   опыты в области экспериментальной фотографии, применяя метод фототипии по новому. На основе фототаксиса эвглены зелёной хочу разработать фотографический метод, который будет пожалуй первым биологическим. Это далеко не все идеи. 

В 2017-2018 учебном году я был учасником конкурса-защиты ученических научных работ Малой Академии Наук Украины. Исследование было перспективным, поэтому я дошёл до последнего этапа, где получил диплом третьей степени.  На последнем этапе  конкурса мне удалось задать несколько вопросов Жюлю Офману. Он несомненно оказал на меня большое влияние. Титанами биологии считаю Роберта Коха, Луи Пастера, Илью Мечникова. Также восхищаюсь пионерами компьютерных технологий, особенно Конрадом Цузе. Из современных изобретателей восхищаюсь Илоном Маском. 

Победа в конкурсе - это прекрасная возможность привлечь внимание общественности и инвесторов к моему исследованию. Полученный грант планирую потратить на обучение в университете по направлению биохимия.

Health & Safety

Исследование проводилось на базе Лаборатории вирусологии Института Сельскохозяйственной Микробиологии и Агропромышленного Производства НААН Украины в городе Чернигове. Оффициальный сайт института: https://ismav.com.ua/

Научный руководитель проекта: Васильченко Анатолий Владимирович, аспирант, руководитель биологического кружка Черниговского отделения Малой Академии Наук Украины. Номер телефона +380969711853

 

Bibliography, references, and acknowledgements

1.Страчунский Л. С., Каманин Е. И. Антибактериальная терапия инфекций в оториноларингологии // Русский медицинский журнал. – 1998. – Т. 6. – №. 11. – С. 684-693.

2.Ефименко О., Украины А. М. Н., Кличко Н. «Бионорика»: с заботой о вашем здоровье.

3.Зоберн В. М., Зоберн О. В. Православный целебник. – Издательский дом "Питер", 2011.

4.Beta // Ботанический словарь / сост. Н. И. Анненков. — СПб.: Тип. Имп. АН, 1878. — XXI + 645 с.

5.Свёкла // Сафлор — Соан. — М. : Советская энциклопедия, 1976. — (Большая советская энциклопедия: [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров ; 1969—1978, т. 23).

6.Красочкин В. Т. Свёкла. — М. — Л.: Сельхозгиз, 1960. — 439 с.

7.Сортоописание овощных бахчевых культур и кормовых корнеплодов, М., 1965.

8.Солодухин Е.Д. Калина. — М.: Лесная промышленность, 1985. — 77 с.

9.Тырышкина О. А., Романова Н. К. Cтаринные рецепты в современных тенденциях функционального и сбалансированного питания //Вестник Казанского технологического университета. – 2012. – Т. 15. – №. 22.

10.Губанов И. А. и др. 1228. Viburnum opulus L. — Калина обыкновенная, или красная // Иллюстрированный определитель растений Средней России. В 3 т  — М.: Т-во науч. изд. КМК, Ин-т технолог. иссл., 2004. — Т. 3. Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). — С. 267.

11.Атлас лекарственных растений СССР / Под ред. Цицина Н. В. — М.: Медгиз, 1962. — С. 212. — 704 с.

12.Товстуха Є.С. Фітотерапія. – К.: Здоров’я, 1990-304с., іл., 6,55 арк. іл.

13.Дудченко Л. Г., Козьяков А. С., Кривенко В. В. Пряно-ароматические и пряно-вкусовые растения: Справочник / Отв. ред. К. М. Сытник. — К.: Наукова думка, 1989. — 304 с.

14.Токин, Б. П. (1974). Целебные яды растений. Повесть о фитонцидах.

15.Токин, Б. П. (2016). Фитонциды. Directmedia.

16.Юрова Е. В. и др. ВЛИЯНИЕ ФИТОНЦИДОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ НА КЛЕТКИ ПРОСТЕЙШИХ //Министерство образования Московской области Государственное образовательное учреждение высшего образования Московской области «Государственный гуманитарно-технологический университет». – Т. 50. – С. 430.

17.Циммер К. Микрокосм: E. coli и новая наука о жизни. – Альпина Паблишер, 2013.

18.Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H (July 1997). «Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks». Clin. Microbiol. Rev. 10 (3): 505–20.

19.Гудзь С. П. Мікробіологія: підручник: [для студ.вищ.навч.закл.]/ С. П. Гудзь, С. О. Гнатуш, І. С. Білінська.—Львів: Видавничий центр ЛНУ імені Івана Франка,2009.—360с.

20. Ehrenberg C. Dritter Beitrag zur Erkenntniss grosser Organisation in der Richtung des kleinsten Raumes //Berlin: Konigl. Akad. d. Wiss. – 1834. – Т. 1833. – С. 145-336.

21.Волкогон В. В. Експериментальна ґрунтова мікробіологія //К.: Аграрна наука.–2010.–55 с. – 2010.

22.Гродзинский А. М., Гродзинский Д. М. Краткий справочник по физиологии растений. – Наукова думка, 1973.- 408 c.

23.Грама метод // Гоголь — Дебит. — М. : Советская энциклопедия, 1972. — (Большая советская энциклопедия: [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров ; 1969—1978, т. 7).

 

 

http://agro-archive.ru

http://green-color.ru

https://scholar.google.com.ua